什麼是 PCR?
The Polymerase Chain Reaction(PCR) 中譯聚合酶連鎖反應，為生物科技中一個極度重要的革命性技術，操作難度不高，但應用面卻極為廣泛，在 1986 年由 Kary Banks Mullis 博士發明，1993年他因這項技術獲得諾貝爾化學獎。
PCR 主要的功能在放大基因序，把微小的 DNA 樣本(可小到 nanogram)複製非常多份，以便後續的分析與操作，例如從刑案現場採集到的微小 DNA，量不足以進行分析，就可以使用PCR放大成足夠的量來進行各項實驗。
PCR 所需材料
- DNA 模板(DNA template)
- 引子(Primers)
- DNA 聚合酶(DNA polymerase)
- 去氧核糖核苷三磷酸(dNTP)
- 緩衝液(Buffer)
PCR 原理
在細胞中 DNA 複製流程大致如下，詳細可參考DNA複製
- DNA 解旋酶解開雙股螺旋
- RNA 引子附著在 DNA 上
- DNA 聚合酶接上 DNA 進行新股合成
現在我們將這個步驟移到試管中
1. Denaturation 變性 [ 94~95℃ , 30-60 sec ]
在細胞中是由DNA 解旋酶解開 DNA 的結構，在細胞外我們使用熱來破壞DNA的氫鍵，迫使他回到單股DNA的形態。
2. Annealing 降溫接合 [ 50~60℃ , 30-60 sec ]
解開後我們加入 RNA 引子，把溫度降到50~60C讓引子能順利地與單股DNA形成氫鍵結，實際上的溫度依照引子的不同種核苷酸數目而定，由以下公式粗略計算。
Tm = ( 4 x [ G+C ] + 2 x [ A+T ]) ℃
這個步驟非常重要，若溫度過低會導致引子與模板不正確的鍵結，溫度過高則引子無法和模板鍵結，通常會以較高的溫度慢慢往下降，因為若一開始溫度過低而錯誤鍵結就失敗了。
3. Extension 延伸 [ 72℃ , 30-60 sec ]
加入 taq polymerase，這是一種由 Thermus aquaticus 耐熱菌株中提取出的 DNA 聚合酶，到94℃仍然不會永久失活，最高效率溫度在72℃，這時DNA聚合酶會從引子的地方進入，並由 3’ 往 5’ 開始 DNA 複製新股。
4. Denaturation II [ 94~95℃ , 30-60 sec ]
第二循環的變性步驟溫度會再回到 94~95℃，這時上個循環合成的DNA新股會脫離變成獨立的新股，同時也成為下一循環的模板，完整PCR 流程約會循環 35 次，大約 2 小時。
PCR 的結束
PCR 是連鎖反應，但不代表他會永無止盡的進行下去，當下面兩項條件達成一項時 DNA 數目會停止增加趨於穩定
- 反應物消耗殆盡
- DNA 聚合酶被破壞
最後的產物要拿去進行瓊脂電泳，確認複製出來的 DNA 片段是否為正確的片段。
設計引子
引子的設計十分重要，兩端引子3’的包含區域暨是被大量複製的DNA序列區域，如果設計錯誤則會導致DNA複製跟著錯誤，也因此引子的特殊性很重要，我們要確保設計出來的引子只會和我們想要的序列區互補，而不會有其他可互補的地方，要做到這一點我們就得增加引子的核苷酸數量，越多特殊性就越高，不過這時問題來了，核苷酸越多越難合成，也會拖慢整個 PCR 過程的效率，那到底該用多少個核苷酸才適合呢?
人類的基因是所有生物中最多的，有 3x109 bp，以簡單的機率估算，會有 1.2x1010 種可能，假設今天我們用八個核甘酸來設計引子，會有 65536 種可能，這樣算出在人類所有基因可以和我們設計的引子序列互補的區塊有 3x109 / 65536 = 46000 個，如果引子和46000個地方互補了，這樣 PCR 還做得下去嗎?!
所以我們會使用17個以上的核苷酸來設計引子，通常取18~20個，因為 3x109 / 417 « 1，在這樣的情況下就能設計出能達到特殊性要求的最短引子。
PCR 應用實例
- 診斷遺傳疾病
- 感染病原檢驗
- 基因複製
- 基因工程
- 親子鑑定
- 法醫鑑識
- 癌症篩檢
- 等等極廣的應用
##### 參考資料 --- 賴雯玲教授 分子生物概論 2018/12/6