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什麼是 PCR?

The Polymerase Chain Reaction(PCR) 中譯聚合酶連鎖反應,為生物科技中一個極度重要的革命性技術,操作難度不高,但應用面卻極為廣泛,在 1986 年由 Kary Banks Mullis 博士發明,1993年他因這項技術獲得諾貝爾化學獎。
PCR 主要的功能在放大基因序,把微小的 DNA 樣本(可小到 nanogram)複製非常多份,以便後續的分析與操作,例如從刑案現場採集到的微小 DNA,量不足以進行分析,就可以使用PCR放大成足夠的量來進行各項實驗。


PCR 所需材料

  • DNA 模板(DNA template)
  • 引子(Primers)
  • DNA 聚合酶(DNA polymerase)
  • 去氧核糖核苷三磷酸(dNTP)
  • 緩衝液(Buffer)


PCR 原理

在細胞中 DNA 複製流程大致如下,詳細可參考DNA複製

  1. DNA 解旋酶解開雙股螺旋
  2. RNA 引子附著在 DNA 上
  3. DNA 聚合酶接上 DNA 進行新股合成

現在我們將這個步驟移到試管中

1. Denaturation 變性 [ 94~95℃ , 30-60 sec ]

在細胞中是由DNA 解旋酶解開 DNA 的結構,在細胞外我們使用熱來破壞DNA的氫鍵,迫使他回到單股DNA的形態。


2. Annealing 降溫接合 [ 50~60℃ , 30-60 sec ]

解開後我們加入 RNA 引子,把溫度降到50~60C讓引子能順利地與單股DNA形成氫鍵結,實際上的溫度依照引子的不同種核苷酸數目而定,由以下公式粗略計算。

Tm = ( 4 x [ G+C ] + 2 x [ A+T ]) ℃

這個步驟非常重要,若溫度過低會導致引子與模板不正確的鍵結,溫度過高則引子無法和模板鍵結,通常會以較高的溫度慢慢往下降,因為若一開始溫度過低而錯誤鍵結就失敗了。


3. Extension 延伸 [ 72℃ , 30-60 sec ]

加入 taq polymerase,這是一種由 Thermus aquaticus 耐熱菌株中提取出的 DNA 聚合酶,到94℃仍然不會永久失活,最高效率溫度在72℃,這時DNA聚合酶會從引子的地方進入,並由 3’ 往 5’ 開始 DNA 複製新股。


4. Denaturation II [ 94~95℃ , 30-60 sec ]

第二循環的變性步驟溫度會再回到 94~95℃,這時上個循環合成的DNA新股會脫離變成獨立的新股,同時也成為下一循環的模板,完整PCR 流程約會循環 35 次,大約 2 小時。


PCR 的結束

PCR 是連鎖反應,但不代表他會永無止盡的進行下去,當下面兩項條件達成一項時 DNA 數目會停止增加趨於穩定

  • 反應物消耗殆盡
  • DNA 聚合酶被破壞

最後的產物要拿去進行瓊脂電泳,確認複製出來的 DNA 片段是否為正確的片段。


設計引子

引子的設計十分重要,兩端引子3’的包含區域暨是被大量複製的DNA序列區域,如果設計錯誤則會導致DNA複製跟著錯誤,也因此引子的特殊性很重要,我們要確保設計出來的引子只會和我們想要的序列區互補,而不會有其他可互補的地方,要做到這一點我們就得增加引子的核苷酸數量,越多特殊性就越高,不過這時問題來了,核苷酸越多越難合成,也會拖慢整個 PCR 過程的效率,那到底該用多少個核苷酸才適合呢?

人類的基因是所有生物中最多的,有 3x109 bp,以簡單的機率估算,會有 1.2x1010 種可能,假設今天我們用八個核甘酸來設計引子,會有 65536 種可能,這樣算出在人類所有基因可以和我們設計的引子序列互補的區塊有 3x109 / 65536 = 46000 個,如果引子和46000個地方互補了,這樣 PCR 還做得下去嗎?!

所以我們會使用17個以上的核苷酸來設計引子,通常取18~20個,因為 3x109  / 417 << 1,在這樣的情況下就能設計出能達到特殊性要求的最短引子。


PCR 應用實例

  • 診斷遺傳疾病
  • 感染病原檢驗
  • 基因複製
  • 基因工程
  • 親子鑑定
  • 法醫鑑識
  • 癌症篩檢
  • 等等極廣的應用


參考資料

賴雯玲教授 分子生物概論 2018/12/6

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