oxygen

生物化學課蛋白質操作相關的筆記。



Protein purification

  1. 溶解度
  2. 大小
  3. 電荷
  4. 特殊結合位


Dialysis 透析

通常不會用來分離不同種類的蛋白質,只會用來去除鹽類(Desalt)或其他小分子

透析三次即可除去大部分雜質


Liquid Chromatography 液相層析

Column chromatography 管柱層析法


Gel Filtration 膠體過濾/分子篩

使用膠體或顆粒透過分子大小進行分群,無法精確區分不同物質

小分子因為會進入膠體內部孔隙,流動速度較慢,大分子直接從膠體間通過,流速較快

分離出來的液體皆為透明,可透過分光光度計檢測吸光度得知含有蛋白質的收集液

可以用來去鹽與緩衝液交換


Ion Exchange 離子交換層析法

將帶有電荷的官能基固定在膠體上,當被檢測物通過時則會依電性吸引

  • 固定相為陰離子:陽離子交換樹脂
  • 固定相為陽離子:陰離子交換樹脂


離子取代優先順序

  1. 電荷高者
  2. 離子大小較大者
  3. 濃度大者

逐步增加鹽梯度,當鹽濃度大於蛋白質濃度時蛋白質會被鹽離子取代而流出,進入收集管


Affinity chromatography 親和性層析法

蛋白質有特定的結合位的話,則可以用他的反應物將蛋白質卡在管中,透過此方法可以收集到90%純度的濾液。

Example:

  1. 準備有葡萄糖殘基的物質固定在管中
  2. 含有葡萄糖結合蛋白的混合物進入管中,葡萄糖結合蛋白與管壁結合
  3. 剩餘廢液流出
  4. 使用高濃度葡萄糖水溶液把管中的葡萄糖結合蛋白置換出來
  5. 成功取得葡萄糖結合蛋白


Protein quantification

UV absorbance

通常使用波長 = 280 nm


Beer-Lambert Law

A = εbC


Biuret method

快速、簡單、但靈敏度低

讓蛋白質與二價銅離子反應,銅離子會結合在肽鏈骨幹上,使待測溶液變成靛色,在經過分光光度計測定吸光度。


Lowry method

增加 Folin reagent 補足 biuret method 低靈敏度的問題

Reagent A: alkaline copper

Reagent B: folin reagent(Phosphotungstic acid + Phosphomolybdic acid)

和銅離子結合的蛋白質進一步還原Folin reagent,放大顏色變化。(鎢藍、鉬藍)


BCA method

biuret method 衍生

BCA = bicinchoninic acid 常用此方法

Cu2+再鹼性環境下會被蛋白質還原成Cu+,Cu+再進一步跟BCA形成紫色結合物。


Bradford method

用 coomassie blue 做蛋白質染色

染色後會變成藍色,再進行吸光度測定。


  1. 先配置已知濃度標準蛋白液,通常用BSA(牛血清白蛋白)。
  2. 做定量並繪製標準曲線。
  3. 待測蛋白質定量,已標準曲線內插得濃度。


SDS-PAGE

SDS

  • 十二烷基硫酸鈉
  • 加入 SDS 共熱,使蛋白質變性
  • SDS 作為界面活性劑,使蛋白質親水呈現線性不凝集
  • SDS 給予蛋白質極大的負電荷,SDS:Protein = 1.4:1
  • f = ma,A為陰電性,
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